I februari 2010 togs ett nytt genetiskt laboratorium i bruk vid Grimsö forskningsstation. Läs mer om laboratoriet





Mer om DNA-information från vargar

Här kan du läsa mer om DNA-analysens användningsområden och hur en analys går till. Skrolla ned på sidan eller gå direkt till önskat avsnitt via länkarna:

DNA-analysens användningsområden inom inventering, förvaltning
och forskning
xxxxKartläggning av släktskap i skandinaviska vargstammen
xxxxInventeringsarbete
xxxxIdentifiering av skadegörande individer

Fakta om DNA-analys
xxxxVad är DNA?
xxxxSå går DNA-analysen till
xxxxTolkning av provet
xxxxFaktorer som påverkar provsvaret
xxxxSammanfattning: Från provtagning till provsvar

Ordlista

DNA-analysens användningsområden inom inventering, förvaltning och forskning

Kartläggning av släktskap i skandinaviska vargstammen

Kartläggningen av släktskapsförhållandena i vargstammen är närmast unik. Vanligtvis är det extremt svårt att upprätta ”stamtavlor” för vilda djur, men i skandinaviska vargstammen är individernas släktskapsförhållanden nästan fullständigt klarlagda.

Eftersom vargforskningen (Skandulv och Lunds Universitet) under flera år har samlat och analyserat prover finns det numera en databas över genetiska profiler från ett stort antal vargar ur den skandinaviska vargstammen. Eftersom vargstammen var liten när forskningen började samla prover har det varit möjligt att bygga upp ett släktträd allteftersom åren har gått och vargarna blivit flera. På senare år har även prover som länsstyrelsernas fältpersonal samlat in under inventeringsarbetet i stor utsträckning bidragit till att fortsätta bygga upp databasen och släktträdet.

Om det finns möjlighet och prover att tillgå analyseras de revirmarkerande djuren i Skandinavien varje eller vartannat år. På så vis upprätthålls information om DNA-profilerna på de revirhävdande djuren. Den informationen är en förutsättning för att man ska kunna härleda andra prover, t ex från skadegörande vargar, till ett särskilt revir. När ett DNA-prov från en varg analyserats kan man genom att jämföra individen mot andra individer i databasen och släktträdet, se i vilket revir den är född, förutsatt att föräldrarna finns i databasen. Precis som vid DNA-analyser av människor använder man sig av ett för ändamålet lämpligt urval gener som ärvs från föräldrar till barn/avkomma.

Inventeringsarbete

Särskiljning av revir

Om snötillgången i ett område är dålig och man därför inte lyckats särskilja observationer av vargspår i ett område där man misstänker att det kan vara två vargpar kan man samla in spillningsprover från vägar och stigar. Har proverna samlats in från spårobservationer med revirmarkeringar (i t ex vägkanter) och de genetiska analyserna av spillningarna från området visar sig komma från fyra olika individer antar man att det rör sig om två olika revirmarkerande par. För att dra en sådan slutsats är det en förutsättning att statusen på de individer man analyserar är känd.

Prover från barmark är alltså alltid svåra att tolka. De insamlade proverna kan komma från ett revirmarkerande par, men även från valpar eller vandringsvargar. Om prover i ett område enbart har samlats på barmark krävs ofta en stor mängd prover innan man kan dra någon slutsats. Det mest rationella, tidsbesparande och billiga sättet är att jobba med prover som samlats in i löpor efter revirmarkerande djur.

Bekräfta föryngring

För att ta reda på om det skett en föryngring i ett område som under föregående vintersäsong (inventeringsperiod) innehållit ett revirmarkerande vargpar så är snöspårning den metod man främst använder idag. Föryngringar kan även bekräftas på barmark genom hörobservationer. Om snötillgången är dålig under vintern kan man samla spillning i reviret för analys.

Vid DNA-analyser av spillningar från ett område med ett revirmarkerande par kan man upptäcka valpar genom att man identifierar nya individer som är släkt med det revirmarkerande paret på ett sätt som bara avkommor kan vara.
Den här metoden fungerar dock bara första gången ett par får valpar, eftersom en analys av en ett prov inte säger någonting om djurets ålder. I ett revir där det fötts valpar flera år i rad kan insamlade spillningar komma från såväl årets valpar som från valpar från föregående års kullar.

Identifiering av skadegörande individer

Spillning

Vid skador på tamdjur eller hundar samlas spillning från rovdjuret om man misstänker att det rör sig om varg. Spillning i direkt anslutning till ett dödat djur kan komma från individen som dödat det, men den kan också komma från andra vargar (ungdjur/valpar) som varit där senare och ätit. Ibland samlas spillningar in från ett större område runt en skadeplats, men sådana prov ger högre osäkerhet om vilka vargar som verkligen varit inblandande i angreppet. Vandringsvargar (unga vargar som letar efter en partner och ett lämpligt område för att bilda ett eget revir) kan finnas över hela Sverige, ibland även i andra vargars revir. Om man vill veta från vilket revir den eller de vargar som varit involverade i ett angrepp kommer är det bättre att bara ta spillning från själva skadeplatsen. Denna information är möjlig att ta fram genom att jämföra de skadegörande vargarnas DNA-profiler med vargindividernas i databasen. För att kunna härleda skadegörande individer krävs dock att databasen över revirmarkerande vargar uppdateras varje säsong.

Saliv - en metod under utveckling

De senaste åren har man i olika delar av världen, bland annat i USA och Europa, gjort försök med att använda sig av DNA som finns i det saliv som ett rovdjur lämnar på ett bytesdjur som det dödat eller angripit. I Sverige är det särskilt utbildade besiktningsmän som avgör vilken sorts rovdjur som dödat ett tamdjur (varg, lo, björn, kungsörn, järv, räv eller hund). Saliv-DNA kan användas som ett komplement till den metoden, i t ex särskilt svårbedömda fall, men man kan också använda det för att utvärdera själva besiktningsmetoden för att se hur bra den fungerar.

Här i Sverige har vi nyligen börjat använda oss av saliv-DNA. Metoden är inte lika utvecklad och etablerad som analyser av DNA från spillning, hår, vävnad och blod är. I saliv är koncentrationen av DNA mycket låg. Det krävs därför en större mängd prover per frågeställning för att analyserna ska kunna ge ett tydligt resultat. En större mängd prover innebär även en högre kostnad per frågeställning, vilket ger en högre total kostnad för saliv-analyserna jämfört med de andra.

Salivprover från rovdjursangripna tamdjur
Idag kan vi med hjälp av DNA ur saliv säga från vilken rovdjursart saliven kommer. Om det finns tillräcklig mängd med DNA kan man teoretiskt även få ut en individuell profil på rovdjuret. Metoden att individbestämma ett rovdjur (gäller bara vargar) från saliv-DNA är under utveckling och vi hoppas att vi får svar på användbarheten under 2008.

Även om ett salivprov innehåller DNA från en viss rovdjursart så betyder det inte per automatik att det är den arten som har angripit tamdjuret. Resultatet måste sättas i sitt sammanhang och stämmas av mot besiktningen som har gjorts på plats. Räv-DNA på ett kadaver kan t ex innebära att en räv har varit där och ätit efter det att djuret dödats.

Salivprover från rovdjursangripna hundar
Genom att analysera rovdjurssaliv som samlats in från skadade eller dödade hundar kan vi idag bara få reda på från vilken art det kommer om det misstänkta rovdjuret är björn (med viss osäkerhet) eller lodjur. Det är tyvärr svårare att avgöra om det är varg som skadat eller dödat hunden eftersom hund och varg är samma art. När DNA från hunden blandas med DNA från vargen blir det en mix av två individer från samma art, vilket komplicerar analysen. Eftersom mängden hund-DNA nästan alltid överstiger mängden varg-DNA är det svårt att hitta vargens profil.

Analyserna av salivprover från skadade och dödade hundar är under utveckling och vi hoppas få svar på användbarheten under 2008. Även om det visar sig vara möjligt återstår frågan vad kostnaden kommer att bli. Det kommer möjligen att röra sig om ganska dyra analyser.

Fakta om DNA-analys

Genetiska analyser av varg kan idag genomföras på olika typer av prover:


*På varje hårstrå sitter en hårsäck som innehåller DNA. Hårstrån utan hårsäck ger inget resultat.
Ett prov med en enda hårsäck ger oftas en mycket begränsad mängd DNA, om någon alls.
Vid extraktion av hårstrån som tagits direkt från hundar använder Lunds Universitet ca 5-7 hårsäckar, vilket resulterar i rikligt med DNA.

Vad är DNA?

DNA (deoxyribonukleinsyra) är en kemisk förening som fungerar som en ”genetisk kod”, en bruksanvisning till alla de proteiner våra kroppar behöver för att fungera. DNA-molekylen är formad som en dubbelspiral, en vriden stege, där stegpinnarna består av par av fyra olika så kallade kvävebaser som förkortas A, T, C och G. Eftersom A alltid binder till T och C alltid till G, är de två strängarna i princip spegelbilder av varandra. Vet man hur den högra strängen ser ut, kan man lätt räkna ut hur den vänstra strängen ser ut. Kombinationen av dessa kvävebaser styr vilka proteiner som bildas.

Kodande och icke-kodande DNA

Endast en tiondel av allt DNA kodar för dessa sekvenser av proteiner, större delen av de resterande 90 procenten är ”icke-kodande” DNA och har ingen känd funktion. Skulle det uppstå en förändring - en mutation - i kodande DNA, fungerar inte genen som den ska och den nya varianten försvinner snart från populationen. Därför har de flesta individer liknande DNA-mönster i kodande gener. Mutationer i icke-kodande DNA kan däremot finnas kvar och öka i frekvens, då det inte innebär att något protein förlorar sin funktion. Icke-kodande DNA varierar därför mellan individer. Det är dessa variationer man använder sig av för att identifiera och skilja individer åt och fastställa släktskap.


Här finns DNA

Varje cell i kroppen (utom i röda blodkroppar) innehåller en komplett uppsättning DNA (hos människor 46 DNA-molekyler, kromosomer). Och var helst vi lämnar ifrån oss några av våra celler så lämnar vi också små mängder DNA. Det finns på urtuggade tuggummin, cigarettfimpar, tappade hårstrån, i avföring och i droppar av blod. Vargen som kliar sig mot ett träd lämnar ifrån sig ett DNA-spår i den lilla hårtussen som blir sittande kvar i barken. När vargen har dödat ett byte finns dess DNA kvar i såret på bytet. Avföring och löpblod innehåller också värdefulla spår av DNA.

Så går DNA-analysen till

DNA-prov som samlas in i naturen innehåller oftast för få celler för att vi ska kunna läsa den genetiska koden. Med hjälp av så kallad PCR-teknik kan man nu kopiera den del av DNA som vi är intresserade av, en så kallad markör. Först då vi har miljontals kopior av markören kan vi läsa DNA-sekvensen bas för bas, bokstav för bokstav (AGTC) eller utveckla snabbare metoder för identifiering av art eller individ.

Att utvinna DNA från ett insamlat prov (DNA-extraktion)

Att kopiera en bestämd del av DNA (PCR-reaktionen)

Primers

En av de viktigaste faktorerna för en fungerande PCR-reaktion är att primern binder in på rätt ställe på DNA-molekylen. För att veta hur den 15-20 baser långa primern ska se ut, krävs att man har sekvensen för den aktuella DNA-regionen exempelvis cyt B-regionen för varg, i annat fall kan man oftast hitta den på GenBank (extern länk), en databas där alla publicerade DNA-sekvenser lagras och görs tillgängliga för allmänheten. Utifrån markörens sekvens, letar man fram en lämplig region att kopiera, och designar sedan två primers (i början och slutet av regionen). Lämplig region kan exempelvis vara en region med lagom mycket variation för att skilja olika arter eller indivder åt.

A C G G G T T C A A A T T G G G C T A C G T A T G G G G T G T G T C A G T
| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
T G C C C A A G T T T A A C C C G A T G C A T A C C C C A C A C A G T C A

Förenklat exempel på design av primers

Tolkning av provet

Att skilja arter åt

Faktorer som påverkar provsvaret

Kvaliteten på provets DNA

Väl fungerande PCR-reaktioner kräver att provet innehåller DNA av tillräcklig mängd och kvalitet. Så snart DNA-molekylen lämnar cellkärnans eller mitokondriens skyddande miljö utsätts den för olika nedbrytande faktorer, såsom cellens enzymer, solens UV-strålar, kroppsvätskor och andra ämnen från den omgivande miljön. Genom att torka, frysa in eller förvara provet i skyddande lösning (buffert) fördröjs nedbrytningen markant. Hanteringen av provet innan det kommer till labbet är alltså oerhört viktig för analysresultatet. Vanligtvis kan man vid analysen se om provet innehållit för lite användbart DNA.

Ju kortare tid ett DNA-prov är utsatt för nedbrytande faktorer som solljus och kemiska substanser, desto större är sannolikheten att det går att analysera. Ett prov som samlats in och konserverats direkt genom förvaring i skyddande buffertlösning, torkning eller nedfrysning och som analyseras så snart som möjligt efter insamlandet har goda möjligheter att ge ett robust svar. Förutom hanteringen av provet är själva insamlandet avgörande för analysernas slutresultat. För att få ett resultat är det nödvändigt att provet från början verkligen innehåller DNA. I ett hårstrå finns det exempelvis bara DNA i hårsäcken och en hårtuss utan hårsäckar ger inget analysresultat. Ett prov från ett bitsår på ett bytesdjur som av slumpen skrapats på ett ställe där rovdjuret inte lämnat ifrån sig saliv innehåller inget rovdjurs-DNA och ger heller inget resultat.

DNA är ett känsligt ämne med begränsad hållbarhet. Liksom hållbarheten hos livsmedel kan förlängas med olika konserveringsmetoder, kan hållbarheten hos DNA förlängas om det hanteras på rätt sätt.

DNA härsknar eller möglar dock inte, utan de långa dubbelspiralerna kan helt enkelt gå sönder, ”brytas ner”, vid felaktig hantering. UV-ljus är exempelvis en effektiv nedbrytare av DNA, liksom upprepad infrysning och upptining av DNA. När DNA brutits ner i alltför små bitar går det inte att analysera.

Att bevara DNA-prover i oändlig tid på labb är inga problem, med tillgång till mörka skåp och frysboxar. Problemet är att provet kan brytas ner under transport från insamlingen i fält till labbets frysboxar. Det gäller alltså att DNA-provet i samband med insamlandet konserveras på ett effektivt sätt. Olika typer av DNA-prov behandlas på olika sätt. Topz som skrapats i ett bitsår för insamling av saliv från rovdjur, torkas några minuter i luften, innan den stoppas i provrör. Avföringsprov fryses in snarast efter insamlandet. Blodprover hälls ner i en konserverande lösning.

Rent generellt är det lättare att identifiera art än att bestämma vilken individ ett prov kommer från. Detta beror bland annat på att man vid artbestämning använder DNA från cellens mitokondrier (mtDNA), som det finns flera av i en enda cell, medan man vid individbestämning använder DNA från cellkärnan som det bara finns en kopia av. Analyser av mtDNA är alltså på grund av den större mängden DNA mindre känsligt för nedbrytning. Prov med små mängder DNA, eller delvis nedbrutet DNA, duger ofta för en artbestämning, medan individbestämning av ett sådant prov är betydligt svårare.

Analysmetoderna

DNA-analyserna fungerar dessvärre inte alltid perfekt. PCR-reaktionen är ofta anpassad för en viss art, men eftersom olika individer inom denna art kan skilja sig åt genetiskt, händer det att reaktionen inte fungerar på alla individer. Det händer också exempelvis att ett prov, insamlat som kommande från varg, i själva verket kom från ett annat rovdjur, vilket ger ett blankt resultat på labbet, som det är svårt att hitta orsaken till.




Sammanfattning: Från provtagning till provsvar

Sedan ett DNA-prov har samlats in, exempelvis från saliv i bitsåret på ett rovdjursangripet tamdjur, sker DNA-analysen enligt schemat nedan.

Ordlista